6. Биотехнологическое получение витамина н (биотина).
Витамин Н не пользуется такой широкой известностью, как, например, витамины А, С и D, но значение его для всех живых организмов от этого ни чуть не умаляется.
Витамин Н (биотин) – кофактор не менее десяти ферментов, ведущих в клетке синтез многих жизненно необходимых веществ. Это значит, что только в соединении с биотином белковые молекулы ферментов обретают каталитическую активность и получают возможность выполнять свою функцию. В отсутствии этого витамина многие важнейшие для клетки процессы прекращаются.
Человека снабжают определенным количеством биотина микроорганизмы, живущие в кишечнике, кроме того, биотин поступает в организм человека вместе с пищей (особенно много его содержится в яичном желтке, дрожжах и цветной капусте), но при нарушении естественной микрофлоры кишечника, что бывает, например, после длительного приема антибиотиков – производительность ее падает и может возникнуть дефицит биотина. К биотиной недостаточности может привести и употребление в пищу больших количеств сырого яичного белка, т.к. в нем содержится гликопротеин, который жадно присоединяет к себе биотин. В результате образуется прочный комплекс, который не переваривается и не усваивается организмом.
Признаками биотиновой недостаточности у человека являются: пепельно-бледная кожа, атрофия сосочков языка, боли в мышцах, сонливость, потеря аппетита, снижение содержания эритроцитов и холестерина в крови.
У животных дефицит биотина выражается в замедленном росте, появлении дерматитов, депигментации, нарушении роста волос: крысы, например, при недостатке биотина становятся почти голыми. Особенно болезненно реагируют на недостаток биотина свиньи и птицы.
Необходим биотин и некоторым видам микроорганизмов, не способным его самостоятельно вырабатывать. К ним относятся, в частности, Corinebacterium, которая широко используется в микробиологической промышленности для синтеза незаменимой аминокислоты лизина – ценной добавки к кормам.
Следовательно, в потребителях биотина недостатка нет. Промышленного производства этого витамина в нашей стране пока не существует, и поэтому его практическое применение сильно ограниченно.
Добывать биотин из природных источников крайне невыгодно, так как для выделения 1 мг витамина необходимо переработать почти 230 кг сухого яичного желтка. Разработаны и методы химического синтеза биотина, но химики получают всего несколько сотен граммов витамина в год, а потребность в нем в тысячи раз выше. Кроме того, химический синтез дает смесь изомеров, которую потом приходится разделять, чтобы получить активный D-биотин.
Остается еще один путь получения биотина – микробиологический синтез. Основной проблемой при получении биотина данным способом явилось то, что микроорганизмы синтезируют биотин в мизерных количествах. Поэтому вначале исследования были сосредоточены на поиске такого микроорганизма, который по своей производительности годился бы на роль продуцента. Было обследовано множество штаммов плесневых грибов, дрожжей, грибов, актиномицетов. Большинство из них оказались неподходящими продуцентами: бактерии ведут обычно очень экономичный образ жизни, строго контролируют свои затраты и лишнего биотина почти не производят.
Более перспективными оказались грибы, особенно те из них, которые растут на богатых органических субстратах. В конце концов, исследователи остановили свой выбор на грибах рода Rhizopus delemar. Это настоящий «рекордсмен» среди микробов: он образует около 1 мг биотина на 1 л среды и большую его часть выделяет наружу.
Следующая проблема, связанная с получением витамина Н микробиологическим путем – проблема масштабирования.
В ходе отбора продуцентов было обнаружено то, что многие штаммы микроорганизмов активно поглощают биотин из внешней среды, накапливая его в своих клетках. Особенно выделяются в этом отношении дрожжи рода Trichosporon; они отличаются способностью поглощать многие органические, в том числе и ароматические вещества, поэтому их широко используют для очистки сточных вод от различных загрязнений. Даже небольшое их количество за час аккумулировало 60 % биотина, содержащегося в культуральной жидкости, а дорогостоящий процесс концентрирования сильно разбавленного раствора биотина данные дрожжи осуществляли быстро и элегантно. К тому же биомасса их нетоксична и может использоваться как кормовая добавка.
Казалось бы, достаточно насытить дрожжи биотином – проблема создания препарата решена, но все оказалось не так просто. Выяснилось, что дрожжи не только поглощают биотин, но еще и разрушают его, и поэтому часть витамина теряется.
На первый взгляд казалось странным, что в природе существуют организмы, разрушающие столь ценное и достаточно химически стойкое соединение, но позже было установлено, что это вовсе не редкое явление. Одни штаммы разрушают биотин, если получают его слишком много, потому что в высоких концентрациях он может быть для них токсичен; другие используют витамин не по назначению, а как источник углерод и азот. Таким образом, дрожжи рода Trichosporon на роль поглотителя витамина явно не подходили – пришлось продолжить поиск.
Предположили, что более бережно будут относиться к витамину организмы, которые, не синтезируя витамина сами, нуждаются в поступлении его извне (ауксотрофы). Поэтому для этой цели были выбраны метилотрофные дрожжи, которые микробиологическая промышленность выращивает на метаноле, и применяющиеся как белковая добавка к кормам животных. Эти дрожжи поглощают биотин даже лучше, чем дрожжи Trichosporon: 95 % биотина, находящегося в среде, переходит в их клетки всего за 20 – 30 мин и биотин при этом остается в целости и сохранности. Таким образом, метилотрофные дрожжи стали вторым компонентом биотинового препарата.
Схема приготовления препарата:
На оптимизированной по составу питательной среде выращивают грибы рода Rhizopus – продуцент биотина. Биомассу гриба отфильтровывают, а к культуральной жидкости, в которую ризопус выделяет большое количество биотина, добавляют метилотрофные дрожжи, которые за короткое время поглощают почти весь имеющийся в среде витамин. Смесь биомассы ризопуса и дрожжей, богатая биотином, и есть биотиновый препарат.
Первая партия, полученная по рассмотренной технологии на Серебрянопрудском биохимическом заводе, была испытана на одной из подмосковных птицефабрик. Цыплята, получившие здесь корм с добавкой разработанного препарата, быстрее росли, меньше болели.
Также препарат был испытан и в совсем другой области – при искусственном выкармливании личинок тутового шелкопряда специально составленными кормами. Было установлено, что в таких кормах при наличии, казалось бы, всех питательных веществ очень мало биотина, а биотиновая недостаточность у шелкопряда приводит к тому, что у него нарушается липидный обмен, снижается содержание С18 – жирных кислот, насекомые болеют и погибают, И поэтому в данном случае препарат приносит немалую пользу.
Таким образом, можно сделать вывод, о том, что созданный биотиновый препарат найдет широкое применение, но для получения чистого биотина, его пока использовать еще нельзя. Точнее, невыгодно, потому что для налаживания экономичного биотехнологического производства чистого биотина нужно, по крайней мере, в 100 – 150 раз увеличить выход целевого продукта, а это за пределами возможностей разработанного штамма – продуцента, следовательно, требуется изменение его генетики, что обычно достигается действием мутагенов, но в данном случае имеется одно трудно преодолимое препятствие: для таких манипуляций гриб не подходит, т.к. после отработки мутагеном популяцию микроорганизмов рассевают на плотную питательную среду, чтобы получить отдельные колонии и отобрать среди них те, в которых произошли нужные мутации, но ризопус не растет в виде отдельных колоний, а быстро занимает всю поверхность плотной среды, так что обычный способ отбора мутантов здесь не годится. Нельзя применить к ризопусу и методы генной инженерии, поскольку его генетика совсем не изучена.
Источник
X Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум — 2018
ПОЛУЧЕНИЕ ВИТАМИННЫХ ПРЕПАРАТОВ
До 30-х годов прошлого столетия рибофлавин (витамин В2) выделяли из природного сырья. В наибольшей концентрации он присутствует в моркови и печени трески. Из 1 т моркови можно изолировать лишь 1 г рибофлавина, а из 1 т печени — 6 г. В 1935 г. обнаружен активный продуцент рибофлавина — гриб эремотециум эшби, способный при выращивании на 1 т питательной смеси синтезировать 25 кг витамина В2. Сверхсинтеза рибофлавина добиваются действием на дикие штаммы мутагенов, нарушающих механизм ретроингибирования синтеза витамина В2, флавиновыми нуклеотидами, а также изменением состава культуральной среды. Отбор мутантов ведут по устойчивости к аналогу витамина В2 — розеофлавину. [1]
Витамин В12 открыт в 1948 г. одновременно в США и Англии. В 1972 г. в Гарвардском университете был осуществлен химический синтез корриноидного предшественника витамина В12. Химический синтез корнестерона — структурного элемента корринового кольца витамина, включающий 37 стадий, в крупных масштабах не воспроизведен из-за сложности процесса.
Первоначально витамин В12 получали исключительно из природного сырья, но из 1 т печени можно было выделить всего лишь 15 мг витамина. Единственный способ его получения в настоящее время — микробиологический синтез. Продуцентами витамина В12 при его промышленном получении служат актиномицеты, метанообразующие и фотосинтезирующие бактерии, одноклеточные водоросли. Для получения высокоочищенных препаратов витамина В12 пропионовокислые бактерии культивируют периодическим способом на средах, содержащих глюкозу, казеиновый гидролизат, витамины, неорганические соли, хлорид кобальта. [4]
Из культуральной жидкости витамин В12 выделяют экстракцией органическими растворителями, ионообменной хроматографией с последующим осаждением из фракций в виде труднорастворимых соединений. В процессе получения витамина В12 с помощью пропионовокислых бактерий применяют дорогостоящую антикоррозийную аппаратуру, сложные и дорогие питательные среды. В последние годы исследуется возможность получения витамина с использованием иммобилизованных клеток пропионовокислых бактерий.[4]
Важное место в обмене веществ у животных занимает р-каротин, который в печени превращается в витамин А (ретинол). В организме человека и животных каротины не образуются. Основные источники р-каротина для животных — растительные корма; человек получает р-каротин также из продуктов животного происхождения. Р-Каротин можно выделить из ряда растительных объектов — моркови, тыквы, облепихи, люцерны. Установлено, что многие микроорганизмы — фототрофные бактерии, актиномицеты, плесневые грибы, дрожжи — синтезируют каротин. [6]
Микробиологическим способом получают и витамин D2 (эрго-кальциферол), при производстве которого освоено дешевое сырье (углеводороды) и установлен стимулирующий эффект ультрафиолетовых лучей на синтез эргостерина культурой дрожжей.
В основном в условиях промышленного производства пантотеновую кислоту получают методом химического синтеза. Наиболее важной коферментной формой витамина В5 является кофермент ацетилирования (КоА). Способностью продуцировать в значительных количествах КоА обладают многие микроорганизмы, в частности актиномицеты. Активно внедряются в промышленное производство способы получения пантотеновой кислоты и ее структурных компонентов из р-аланина и пантотеата калия с помощью иммобилизованных клеток бактерий, а также достигнуты существенные успехи при получении КоА с использованием мутантных штаммов Brevibacterium ammoniagenes, которые позволяют получать КоА в количестве до 3 г на литр. [8]
Одним из наиболее распространенных биотехнологических способов получения коферментной формы никотиновой кислоты — никотинамидадениндинуклеотида (НАД) является выделение (экстракция) его из микроорганизмов, как правило, из пекарских дрожжей. Для повышения содержания НАД в дрожжевых клетках культивирование проводят на средах с предшественниками синтеза никотиновой кислоты. Так, при добавлении в среды культивирования аденина или самой никотиновой кислоты получают до 12 мг НАД на 1 г клеток (по сухой массе).
Аскорбиновая кислота в мировом промышленном производстве витаминной продукции в целом занимает наибольшую долю — около 40 тыс. т в год. Ее синтез был разработан швейцарскими учеными А. Грюсснером и С. Рейхштейном в 1934 г. и используется до настоящего времени. Синтез аскорбиновой кислоты является многостадийным химическим процессом, в котором только одна стадия представлена биотрансформацией. Эта стадия трансформации d-сорбита в L-сорбозу при участии ацетатных бактерий. Для получения сорбозы используют глубинную ферментацию, когда культуру продуцента Gluconobacter oxydans выращивают в ферментерах периодического режима с мешалкой и барботером для усиления аэрации и массообмена в течение 20 — 40 ч с результатом по выходу сорбозы до 98% исходного количества сорбита в среде. Обычно для достижения такого высокого выхода целевого продукта в питательную среду вносят кукурузный или дрожжевой экстракт в количестве около 20%. По окончании ферментации сорбозу выделяют из культуральной жидкости. Помимо оптимизации среды можно совершенствовать и технологическую аппаратуру. Например, переход от периодического культивирования продуцента Gluconobacter oxydans к непрерывному, в аппарате колоночного типа увеличивает скорость образования сорбозы в 1,7 раз. [3]
Впервые кальциферол был выделен из рыбьего жира в 1936 г. А. Виндаусом и применен при лечении рахита. Он получил название витамина D3, так как ранее из растительных масел был выделен эргостерин под названием витамин D, при облучении которого получили витамин D2 — эргокальциферол (кальциферол — в переводе «несущий кальций»).
В настоящее время кальциферол производят из эргостерина с применением УФ-облучения биотехнологическим методом. В процессе преобразования эргостерина в эргокальциферол принимают участие микроорганизмы. Особенно богаты эргостерином клетки дрожжей всех видов и плесневые грибы. В сухой биомассе дрожжей содержится 5—10% эргостерина.
При дальнейшем УФ-облучении эргостерина получают витамин D2, который либо используется как пищевая добавка, либо подвергается дальнейшей обработке с целью получения кристаллического витамина D2. [5]
Витамин А — циклический, непредельный одноатомный спирт, образуемый в слизистой кишечника и печени из провитаминов под воздействием фермента каротиноксидазы. Каротиноиды — широко распространенная группа природных пигментов, образуемых высшими растениями, водорослями и некоторыми микроорганизмами. У животных эти пигменты не образуются, а поступают с продуктами питания и служат источником витамина А. [10]
Убихиноны в последнее время вызывают интерес как перспективные лечебные препараты. С одной стороны, они синтезируются в организме животных и человека, делая необязательным их поступление с пищевыми продуктами, что отличает их от группы витаминов.
В производстве убихинонов применяются биотехнологические методы, в основе которых лежит экстракция из биологического материала. В промышленном производстве убихинонов, в качестве субстрата используются как растительные ткани, так и микроорганизмы с высоким содержанием убихинонов, например дрожжи и грибы.
В настоящее время используется биотехнология получения уби-хинона-9 и эргостерина из микробных липидов, являющихся побочным продуктом крупного производства белково-витаминного концентрата при выращивании грибов Candida maltosa. [11]
Витамины необходимы для образования иммунных клеток и антител. Суточная потребность в витаминах может быть небольшой, но именно от обеспеченности витаминами зависит нормальная работа иммунной системы и энергетический обмен. Вот почему витаминный дефицит ускоряет старение организма и увеличивает частоту возникновения инфекционных заболеваний и злокачественных опухолей, что значительно сокращает продолжительность и качество жизни.
Специалисты рекомендуют принимать препараты, которые содержат в своем составе весь спектр жизненно важных витаминов, причем, что не менее важно, комплекс должен быть качественным и хорошо сбалансирован по дозировкам. Это будет гарантией эффективности и безопасности препарата. Высокое качество и оптимальные дозировки витаминов позволяют значительно снизить риск аллергических реакций, которые, к сожалению, нередко встречаются в последнее время.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1. Карелин А.О. , Ерунова Н.В. «Витамины». — М.: серия советы доктора, 2002. — 160 с.2. Вент Ф. «В мире растений», -М.,1993 г. — 232 с3. Блинкин С.А. « Имунитет и здоровье», -М.: Знание. 1977г. — 316 с4. Вершигора А.Е. «Витамины круглый год»,-М 2007 г. — 159 с
6. Яннус А. Э. и Коллас С. Ю. Микробиология, эпидемиология и иммунобиология, 2010 г. — 426 с
7. Фердман Д. Л. В кн.: Витамины. Изд. АН УССР. Киев, 1986 г. — 285 с
8. Смирнова Л. А. Витаминные ресурсы. Витамин В12, его биосинтез, функции и применение. Изд. АН СССР. 1961 г. — 150 с
9. Минкина А. И. Биохимия, 2003 г. — 215 с
10. Игнатова Л. Н. Клиническая медицина, 2006 г. — 652 с
11. Березовский В. М. Химия витаминов. М., 1999 г. — 326 с
Источник